Uni Fakultäten Fk. V Biologie Biochemie Toxikologie FPraktikum Übersicht   

FORTGESCHRITTENEN-PRAKTIKUM BIOCHEMIE

Umwelttoxikologie

apl. Prof. I. Witte

Allgemeine Bemerkungen

Die angebotenen Versuche können unter dem Themenkomplex "Wirkung von Schadstoffen auf die DNA" und auf ganze Zellen zusammengefaßt werden.

Da in dem genannten Arbeitsbereich die Ausgangsmaterialien für die Versuche nicht käuflich bzw. sehr teuer sind, müssen sie z.T. selbst hergestellt werden. Nachdem das "Handwerkszeug" gewonnen ist, können Versuche zur eigentlichen Thematik begonnen werden, wobei im Rahmen der Möglichkeiten auch auf Vorschläge eingegangen werden kann und einige Versuche je nach Interesse als Wahlversuche angeboten werden können.

Umgang mit gesundheitsgefährdenden Stoffen

Es sollte prinzipiell mit der kleinsten benötigten Menge gearbeitet werden. Es stehen deshalb für Lösungen 1-ml- und 2-ml-Kölbchen zur Verfügung. Hier einige Grundregeln: Einwaagen nie unter Zeitdruck durchführen; eine Einweisung durch einen Betreuer ist dringend notwendig! Immer mit einem Handschuh arbeiten, und mit dieser behandschuhten Hand nur das anfassen, womit der Schadstoff in Berührung kommt, nur so können Kontaminationen vermieden werden. Die Waage immer total sauber verlassen (auch nach Einwiegen von ungefährlichen Stoffen). Reste und Abfälle nie in das Abwasser geben, sondern in bereitgestellte Abfallflaschen.

Einige wichtige Tips zum besseren Arbeitsablauf im Praktikum:

Das Spülen

Es sollte ein Spüldienst eingerichtet werden, so daß die Glasgefäße und Geräte zum nächsten Tag wieder zur Verfügung stehen. An der Spülmaschine liegt eine Bedienungsanleitung. Alle Sachen werden nach dem Spülen im Trockenschrank über Nacht getrocknet.

Das Autoklavieren

Bitte mit anderen Gruppen absprechen, wann und was autoklaviert werden soll. Günstig ist es auch, wenn alle Gruppen einen gemeinsamen Vorrat an Pipettenspitzen, Bechergläsern, Eppendorfcaps und Flaschen anlegen, der dann von Zeit zu Zeit wieder aufgefüllt wird. Den Autoklaven nur unter Anleitung eines Betreuers benutzen.

Das Bedienen der Waagen

Es sollte jeder eine Einweisung von einem Betreuer im Bedienen der Analysenwaage erhalten. Nach dem Benutzen die Waage sauber verlassen. Gifte werden grundsätzlich im Dunkellabor der Zellzucht abgewogen. Hier bedarf es noch einer speziellen Einweisung!

Alle Versuche sollten einen Tag zuvor mit einem Betreuer durchgesprochen werden, Pläne müssen vorliegen. Vor dem Versuch klären, welche Bereiche steril, mit Handschuhen und in der Kälte gemacht werden müssen. Rotoren brauchen zum Durchkühlen mehrere Stunden, bitte bedenken. Wichtig ist, die Konzentrationsbereiche der Giftstoffe vor einem Versuch zu diskutieren und zu klären und einen Versuchsplan einen Tag vor Versuchsdurchführung fertigzustellen. Welche 0-Kontrollen sind notwendig?

Zu den Gelversuchen

Zu jedem Versuch muß ein Geltaschenplan erstellt werden, damit die richtige Zuordnung auf dem Foto erfolgen kann. Das Ethidiumbromid zum Anfärben der Gele wird immer im Dunkellabor verdünnt. Es stehen hierfür Lösungen, Kolben und Pipetten bereit. Es wird mit Leitungswasser verdünnt. Die Gefäße werden immer wieder benutzt. Das angefärbte Gel ganz genau auf die UV-Platte legen, da sonst unnötige Ausdrucke gemacht werden müssen. Die Bedienung der Apparate nicht mit Handschuhen handhaben, da eine Verschmutzung mit Ethidiumbromid möglich wird, also Achtung! Die UV-Lampe nur so kurz wie absolut nötig anschalten, da sonst die Quarzplatte solarisiert und somit für UV-Licht undurchlässig wird.

Dialyse

Die Dialyseschläuche werden entweder in 1 % Na₂CO₃ besser im passenden Puffer gekocht, 30 Min. Die Schläuche nicht zu kurz abschneiden, sie müssen vor der Benutzung abgekühlt sein.

Puffer

Ein Puffer sollte zuerst in einem Erlenmeyerkolben mit weiter Öffnung angesetzt werden, dann der pH eingestellt werden und erst jetzt in einen Meßkolben überführt werden. Der pH-Wert wird nur mit Ionen eingestellt, die schon im Puffer vorhanden sind. Tris-Puffer wird mit HCl eingestellt. Ein Puffer braucht etwas Zeit, sich einzustellen. Ideal ist es, ihn über Nacht im Kühlraum aufzubewahren, auf Zimmertemperatur zu bringen, neu pH messen und nun auffüllen.

Tris-Puffer kann nicht autoklaviert werden!

Bitte in die Wasserbäder nur Dest-Wasser einfüllen und kein Bi-dest.

Aufräumen

Schadstoffreste in entsprechende Abfallbehälter ("halogenierte Lösungsmittel", halogenfreie Lösungsmittel, Säuren, Basen) MTT-Reste in Abfallbehälter: MTT-Abfall, SDS-Lysepuffer in Abfallbehälter: "halogenfreie Lösemittel". Medien- und SFM-Reste in den Abfallflaschen auf den Spültisch.

Literatur

Allgemein aus Lehrbüchern der Biochemie bzw. Genetik die Kapitel:

Bau und Funktion der DNA
Mutationen
DNA-Reparatur
Enzymatische Aktivitäten an der DNA
Cytochrom-P450-Enzymsystem
Enzymkinetik
Toxikologie

Zu empfehlen sind neben den Standard-Werken der Biochemie folgende Bücher:

Marquardt, H., Schäfer, S.G. (Hrg.) (1997): Lehrbuch der Toxikologie; Spektrum Akademischer Verlag, Heidelberg, Berlin.
Halliwell, B. und Gutteridge, J.M.C. (1989): Free radicals in biology and medicine. Oxford University Press. Oxford.

Die genannten Bücher sind in der Bibliothek vorhanden.

Als allgemeine gut verständliche Bücher über biochemische Methoden können empfohlen werden.: 1. B. L. Williams und K. Wilson: Methoden der Biochemie, Thieme, Stuttgart, 1991. 3. Aufl. 49,90 DM. 2. Alfred Pingoud, Claus Urbanke: Arbeitsmethoden der Biochemie, de Gruyter Lehrbuch, 1997. 48,00 DM.